Estudio de la relación exposición y respuesta en el tratamiento con antifúngicos

Micología

Nuevos antifúngicos y aspergilosis crónicas.

Epidemiología, resistencia y actividad de nuevos antifúngicos

El conocimiento de la epidemiología y la tasa de resistencia a los antifúngicos es esencial para un manejo adecuado de los pacientes y una estrategia de detección y diagnostico apropiada. La resistencia a los antimicrobianos es hoy una de las mayores amenazas para la salud mundial siendo el desarrollo y comercialización de nuevos compuestos una de las prioridades del sector de la salud. Se han realizado en colaboración con centros del Sistema Nacional de Salud varios estudios poblacionales, con el fin de conocer la epidemiología de los hongos filamentosos en España y la tasa de resistencia a los antifúngicos. Se ha encontrado que más de un 10% de las infecciones por hongos filamentosos están producidas por especies crípticas que suelen ser más resistentes a los antifúngicos. En los últimos años han aparecido varios compuestos con capacidad antifúngica que están en diferentes fases de desarrollo, en nuestro grupo se ensayan estos nuevos compuestos frente a los principales géneros de especies patógenas, incluyendo las especies crípticas multiresistentes. 

Aspergilosis Pulmonar Crónica y Aspergilosis Broncopulmonar alérgica

Estas enfermedades ocurren generalmente en personas inmunocompetentes. La incidencia de estas enfermedades es prácticamente desconocida. La ausencia de un diagnóstico apropiado y del tratamiento óptimo complica el manejo de estos pacientes. Varios estudios han documentado la presencia de cepas multiresistentes en estos pacientes, debido a tratamiento prolongados. En esta línea se está trabajando en mejorar el algoritmo diagnóstico de estas enfermedades, así como analizar la epidemiología de las especies aisladas en estas infecciones y la influencia de cambios en el micobioma pulmonar y ambiental.
 

Enfermedades fúngicas y Salud global

Muchos países de renta media y baja se encuentran en zonas de alta incidencia de hongos, sin embargo, tienen menos herramientas y capacidad diagnóstica para manejarlas. Con el fin de conocer la incidencia de las infecciones oportunistas por hongos y disminuir la muerte asociada a las mismas en pacientes que viven con VIH en Guatemala y en colaboración con el Fondo de acción Global para las infecciones fúngicas (GAFFI), se ha desarrollado una red de unidades de atención integral al sida e implementado un laboratorio central de diagnóstico, que hace de referencia para el diagnóstico en varias infecciones oportunistas. Se ha hecho un estudio de cohortes incluyendo a más de 2500 pacientes HIV+ con un seguimiento de un año. Se han tamizado las principales infecciones fúngicas en este grupo de pacientes permitiendo el acceso al diagnóstico y al tratamiento de las mismas en la mayor parte del país y consiguiendo una disminución de mortalidad en un año del 7%.

Mecanismos de Resistencia de Aspergillus fumigatus a los antifúngicos

Aspergillus fumigatus es un hongo patógeno oportunista de distribución universal, que tiene una incidencia mundial muy significativa y una mortalidad elevadísima.  El uso extensivo y generalizado de los antifúngicos ha originado la aparición de A. fumigatus resistentes a los mismos, ocasionando graves consecuencias para los pacientes infectados por estos aislados que ven reducidas sus opciones terapéuticas. 

Inicialmente la aparición de cepas resistentes fue muy esporádica y mostraban mutaciones puntuales en zonas clave del enzima Cyp51A (G54, G138, F219, M220, G448S) en las cepas que se aislaban en pacientes sometidos a tratamientos de larga duración con azoles. Esta ruta clínica es debida a la presión selectiva que los azoles ejercen sobre A. fumigatus en el interior del paciente. Sin embargo, desde el año 2014 la resistencia ha crecido de manera notable y casi todas las cepas de A. fumigatus resistentes a los azoles tienen un mecanismo combinado de modificaciones en el promotor y la parte codificante de cyp51A (TR34/L98H o TR46/Y121F/T289A) y que, con una elevada frecuencia, se detectan en pacientes que jamás han sido expuestos a terapia antifúngica. En estos casos se plantea la implicación de una ruta ambiental en la que la exposición no intencionada de A. fumigatus a DMIs en el campo estaría favoreciendo la aparición de aislados resistentes.

Origen y Evolución de la Resistencia de A. fumigatus a los antifúngicos

Hoy en día, el aislamiento de cepas de A. fumigatus resistentes a antifúngicos es una emergencia global en aumento. Se cree que la exposición continuada de A. fumigatus a fungicidas ambientales, utilizados para la protección de cultivos contra otras especies de hongos que causan daños agrícolas, está seleccionando cepas resistentes a múltiples fármacos. Los principales mecanismos de resistencia a los azoles en A. fumigatus son cepas con modificaciones de la diana de los azoles (gen cyp51A), principalmente el TR34/L98H, seguido por TR46/Y121F/A289T. Ambos tipos de mecanismos son responsables de la resistencia a todos los azoles y cruzada a los DMI utilizados para la protección de cultivos (imidazoles y triazoles). Más recientemente, también se ha reconocido la resistencia a varias clases de fungicidas como, Bencimidazoles (MBC), Estrobilurinas (QoIs), inhibidores de la sucinato deshidrogenasa (SDHIs) y Dicarboximidas.


La caracterización genomica (NGS) de cepas procedentes tanto de origen clínico como ambiental permite vincular las diferencias del genoma con la adquisición de resistencia a distintos fungicidas. Al añadir los datos de susceptibilidad a antifúngicos no azólicos se puede observar una imagen más precisa de las relaciones filogenéticas entre las cepas ya que se forman distintos subclados en los que coinciden las cepas multirresistentes a los antifúngicos no azólicos, con cepas resistentes a los azoles con los mecanismos TRs. Esta formación de clados específicos con cepas que difieren en cuanto a origen geográfico y año de aislamiento sugiere la existencia de un nexo común, un punto de origen evolutivo según el cual las cepas se han desarrollado bajo unas circunstancias similares que confluyen en una serie de mecanismos de multirresistencia a fungicidas de distintas familias. Los funqicidas no azolicos son de uso exclusivo ambiental, y la resistencia de A. fumigatus a los mismos confirma que las cepas con mecanismo de resistencia a TRs, se seleccionan y desarrollan en el ambiente donde se ven expuestos a la presión selectiva de múltiples fungicidas.

Se cree que las cepas con mecanismos TRs podrían estar asociadas a una ventaja evolutiva o mejora en su "fitness" que pueda favorecer su supervivencia y dispersión en un ambiente muy cargado de fármacos. Esta tendencia de las cepas a adquirir multitud de mutaciones responsables de resistencia a varias familias de fármacos nos ha hecho explorar las alteraciones de los genes de la vía de reparación del ADN. 

Tolerancia y persistencia a los antifúngicos azólicos en Aspergillus fumigatus

La tolerancia y la persistencia son dos fenómenos por los cuales los organismos patógenos pueden sobrevivir la acción microbicida de antimicrobianos que deberían matarlos durante un período de tiempo extendido. En el laboratorio investigamos la capacidad de algunos aislados de A. fumigatus de mostrar tolerancia y persistencia a los azoles, primera línea de tratamiento antifúngico contra las infecciones de aspergilosis. Por una parte, desarrollamos metodología para detectar e investigar la tolerancia/persistencia, tanto en el laboratorio como en diagnóstico clínico. Con estos métodos estamos estudiando los mecanismos moleculares y genómicos subyacentes que posibilitan estos fenómenos. Por último, estamos investigando la potencial relevancia de la tolerancia y la persistencia en la eficacia del tratamiento antifúngico.

Modulación diferencial de la persulfidación en el hongo y el hospedador como nueva estrategia antifúngica

La persulfidación es una modificación postraduccional en la cual un grupo sulfuro activado (S2), mediante la acción de una enzima, realiza un ataque nucleofílico específico sobre grupos tiol (-SH) de residuos cisteína en proteínas diana para formar un grupo persulfido (-SSH). Se ha demostrado que esta alteración modula la actividad intrínseca de las proteínas, resultando en un papel relevante en diversos mecanismos celulares y funciones fisiológicas. En nuestra investigación previa demostramos que niveles correctos de persulfidación son importantes tanto para la virulencia de A. fumigatus, como para la orquestación de una respuesta inmunitaria adecuada en el hospedador. Por tanto, en esta línea de investigación estudiamos la hipótesis de que la modulación diferencial de la persulfidación puede constituir una nueva estrategia para el tratamiento antifúngico. Por una parte, estamos investigando la capacidad de compuestos de inhibir la acción de enzimas fúngicas que realizan la persulfidación, con el objetivo de reducir los niveles de persulfidación y por tanto disminuir la virulencia de A. fumigatus. Por otra parte, estudiamos el uso de donadores de sulfuro como potenciales vías para incrementar la persulfidación en las células pulmonares del hospedador, con el objetivo de potenciar la respuesta inmunitaria. 

Evolución de las resistencias cruzadas a los nuevos antifúngicos olorofim y manogepix

La resistencia a los azoles se encentra ya presente a nivel global. Se ha demostrado que los mecanismos de resistencia más comunes (consistentes en la repetición en tándem de secuencias en el promotor del gen que codifica la diana de los azoles) se han desarrollado en el campo, debido a la utilización indiscriminada de pesticidas de la misma familia que los azoles clínicos. En este momento, existen dos nuevos antifúngicos clínicos con nuevos mecanismos de acción molecular, el olorofim y el manogepix. Sin embargo, también se han desarrollado análogos para su uso como pesticidas, con el mismo mecanismo de acción, el ipflufenoquin y el aminopyrifen. Por tanto, estamos en riesgo de cometer el mismo error que con los azoles. En este proyecto de colaboración internacional, estudiamos la evolución de resistencias y cros-resistencias a estos antifúngicos clínicos y ambientales, con el objetivo de poder diseñar estrategias para minimizar la aparición de resistencias en el ambiente y para desarrollar métodos de detección temprana de las resistencias.

Susceptibilidad del huésped a las infecciones fúngicas invasoras

Se estima que más de un millón y medio de personas mueren al año en el mundo debido a una enfermedad fúngica invasora (EFI). Los tratamientos con inmunosupresores, terapias con corticoides, trasplantes de células hematopoyéticas y órgano sólido así como tratamientos quimioterapéuticos contra el cáncer han favorecido el aumento de estas infecciones fúngicas. El género Aspergillus es la principal causa de EFI por hongos filamentosos, siendo A. fumigatus la especie principalmente aislada en la mayoría de los casos y más frecuentemente asociada a Aspergilosis Invasora. 
Muchas de estas infecciones están infra-diagnosticadas debido, tanto a la falta de sospecha clínica como a las limitaciones diagnósticas. Esta línea de investigación tiene como principal objetivo mejorar el pronóstico de la infecciones en pacientes con riesgo de desarrollar infecciones invasoras por hongos. Para ello se estudian marcadores del individuo (denominados biomarcadores del hospedador) que puedan ser detectados de forme temprana en muestras de pacientes en riesgo y que nos permita estratificar a los mismos en función de la susceptibilidad a desarrollar una infección invasora por hongos. Además, estudios realizados en los últimos años muestran que el fondo genético del hospedador está asociado con la predisposición al desarrollo de este tipo de enfermedades. En concreto se han identificado polimorfismos genéticos de nucleótido simple (“Single Nucleotide Polymorphism”- SNP) en genes que codifican para componentes celulares que interaccionan con estructuras  fúngicas y/o que están involucradas en la respuesta inmune del huésped frente a agentes infecciosos como Aspergillus. En este sentido se han estandarizado y aplicado herramientas para la detección de SNPs en humanos de genes diana asociados concretamente con la susceptibilidad a la Aspergilosis Invasora.

Estudio de los mecanismos de virulencia en Aspergillus fumigatus

En paralelo al estudio de la respuesta del hospedador se sigue una línea cuyo objetivo es caracterizar mecanismos de virulencia en A. fumigatus. Uno de los principales mecanismos por los que A. fumigatus es capaz de causar enfermedad en humanos es su capacidad de adaptarse a las condiciones ambientales del hospedador. Entre las moléculas y los genes que se han relacionado con la virulencia de este hongo se encuentran componentes de la pared celular, genes y moléculas relacionadas con la evasión de la respuesta inmune, sistemas de detoxificación de los compuestos derivados del oxígeno, la producción de toxinas, la obtención de nutrientes como hierro, fósforo, nitrógeno y la adaptación a pH y temperatura del hospedador.  Estos estudios permiten profundizar en el conocimiento sobre la patogenicidad de este hongo e identificar nuevas dianas terapéuticas

Mecanismos de adaptación de hongos patógenos al huésped: Morfogénesis en Cryptococcus neoformans

Uno de los principales mecanismos por los que los hongos son capaces de causar enfermedad en humanos es su capacidad de evadir la respuesta inmune y adaptarse a las condiciones ambientales que se encuentra en el huésped. En este sentido, una de las levaduras tiene que mayor capacidad de adaptación al huésped es Cryptococcus neoformans. Este hongo se encuentra en el ambiente, y se adquiere por inhalación, aunque el cuadro más típico es meningitis en pacientes inmunodeprimidos, principalmente VIH+. La principal característica fenotípica es la presencia de una cápsula de polisacárido que rodea a la célula que es considerado un factor de virulencia. Además, C. neoformans es capaz de aumentar el tamaño celular significativamente formando células “titanes”, que pueden alcanzar un diámetro de más de 70 micras. En el laboratorio estamos interesados en conocer cual es el papel de estos las células titanes en la virulencia de C. neoformans. Recientemente, hemos descrito medios in vitro en los que C. neoformans forma células pseudo-titanes, lo que nos ha permitido identificar nuevos factores y rutas involucradas en este proceso.

Mecanismos de acción a antifúngicos

En paralelo, llevamos una línea cuyo principal objetivo es caracterizar los mecanismos de acción de los antífúngicos. En concreto, se ha centrado el trabajo en el efecto de la Anfotericina B (AmB). Durante décadas se ha pensado que este antifúngico causa la muerte de las células tras la unión a ergosterol y formación de poros. Nuestros resultados indican que este antifúngico induce también un fuerte estrés oxidativo en la célula, el cual ocurre antes de que se pierda la integridad celular. Además hemos comprobado que el estrés oxidativo es necesario para la acción fungicida de la AmB. Estos resultados abren la puerta a diseñar nuevas estrategias que mejoren su eficiencia en pacientes.

Nuevas estrategias terapéuticas

El trabajo con AmB ha derivado en investigación orientada a mejorar las terapias antifúngicas. En particular, hemos utilizado la estrategia del reposicionamiento de fármacos “off-patent” para buscar nuevas actividades. Usando este abordaje, hemos identificado varios fármacos que aumentan la efectividad de la AmB frente a las principales levaduras patógenas, como el antibiótico eritromicina. Este abordaje nos ha permitido identificar fármacos con actividad antifúngica frente a patógenos emergentes, como Candida auris.

​El diagnóstico de la infección fúngica invasora (IFI) es complicado y con frecuencia se retrasa ya que en muchas ocasiones a la falta de sospecha clínica se le suma la falta de herramientas diagnósticas eficaces. Esta línea de investigación se inició en el año 2003, primero liderada por el Dr. Manuel Cuenca-Estrella y posteriormente por la Dra. María José Buitrago con el objetivo general de desarrollar nuevas herramientas, basadas en la PCR en tiempo Real, para un diagnóstico rápido de IFI. Los objetivos concretos que se han ido alcanzando a lo largo de estos años han sido los siguientes:

Detección precoz de hongos causantes de infecciones fúngicas oportunistas más frecuentes en pacientes inmunodeprimidos (Aspergilosis y Candidiasis invasoras)

Se han desarrollado y validado técnicas de PCR en tiempo Real en formato multiplex para el cribado de pacientes en riesgo de padecer estas infecciones, así como para el diagnóstico en pacientes con sospecha.

Detección de IFIs causadas por hongos emergentes (Escedosporiosis, Fusariosis etc...)

El aumento de especies raras o poco frecuentes causantes de IFI hizo necesario el desarrollo de técnicas para su detección

Detección “panfúngica”

Para aquellos casos en los que no exista evidencia clara del hongo causante de la infección se han desarrollado técnicas basadas en PCR en tiempo Real.   

Mejora del diagnóstico y la identificación de los hongos causantes de micosis importadas (micosis endémicas)

Debido al aumento de la inmigración y los viajes a lugares exóticos en los últimos años se ha producido un incremento de las micosis importadas en España, en concreto de aquellas causadas por hongos endémicos de determinadas regiones, los cuales son además patógenos primarios. Este objetivo es relevante en el contexto de una región no-endémica ya que existe falta de experiencia en el manejo de estas infecciones y las técnicas diagnósticas disponibles son muy escasas. A lo largo de estos años se han desarrollado y validado distintas técnicas para el diagnóstico rápido de estas micosis y se han realizado diferentes trabajos encaminados a un mejor conocimiento de los hongos que las causan.

Las técnicas desarrolladas a lo largo de estos años se han incorporado a la Cartera de Servicios del Centro Nacional de Microbiología para ofrecerlas al Sistema Nacional de Salud. Además, algunas de ellas se han patentado.